截止今天，2019-nCoV已經(jīng)在多國出現(xiàn)，在中國人教科書式的疫情戰(zhàn)役之后，突然在韓國、日本、意大利、伊朗、新加坡等國家出現(xiàn)明顯的確診病例增長，顯然這已經(jīng)是所有人應(yīng)該重視應(yīng)對的問題了。

我們知道2019-nCoV具有很強(qiáng)的傳染性，隔離措施是非常必要的，針對疑似病例診斷的可靠性就是重中之重了。在前段時間，我們發(fā)現(xiàn)臨床的核酸診斷出現(xiàn)很大概率的假陰性，繼而確診時我們就結(jié)合了臨床指標(biāo)，確保每個病人能及時準(zhǔn)確的得到治療。

那我們不禁會問：核酸檢測作為金標(biāo)準(zhǔn)，為什么會出現(xiàn)這么大的假陰性概率？原因是多方面的，比如取樣部位的差異，潛伏期病毒滴度低，Q-PCR的相對定量判斷原則，試劑盒的檢測限等等。

科佰生物作為一家提供診斷標(biāo)準(zhǔn)品和藥物研發(fā)模型的公司，今天就這診斷和藥物研發(fā)兩方面我們做下討論。

我們可以分析下2019-nCoV的結(jié)構(gòu)，與其他beta類冠狀病毒一致，一類具有囊膜、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，其中關(guān)鍵的基因有ORF1ab、Gene S、Gene E、Gene M和Gene N。

1. ORF1ab包含RdRP（RNA-dependent RNA polymerase），RNA聚合酶用于RNA的合成，常被用于診斷；

2. S蛋白，穿過病毒膜，并在冠狀病毒“冠狀”中形成特征性的尖峰，它被高度糖基化，可能形成同源三聚體，并介導(dǎo)受體結(jié)合和與宿主細(xì)胞膜融合，刺激中和抗體的主要抗原以及細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞的重要靶標(biāo)在S蛋白上，被用于藥物研發(fā)。

3. 小包膜E（envelope protein）蛋白將其C末端留在包膜內(nèi)，然后跨越該包膜或彎曲并在內(nèi)部投射其N末端。

4. M蛋白（membrane glycoprotein）具有一個短的N末端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在包膜的外表面上突出并跨過該包膜3次，在包膜內(nèi)留有一個長的C末端，M蛋白在病毒裝配中起重要作用。

5. 核衣殼蛋白N（nucleocapsid phosphoprotein）與RNA基因組結(jié)合形成核衣殼。它可能參與病毒RNA合成的調(diào)控，并可能在病毒出芽過程中與M蛋白相互作用。

用于診斷的假病毒標(biāo)準(zhǔn)品

根據(jù)WHO公布，的診斷主要是圍繞N基因，另外附加其他的基因作為確認(rèn)，對應(yīng)的protocol，請點(diǎn)擊查看。

N基因，全長1260bp，以美國CDC為例，直接在N基因中選擇了3對引物、探針，而且對N1、N2、N3都做了特異性比對分析和特異性檢測分析，結(jié)論是N1和N2都是非常特異的，N3能同時檢測SARS和bat SARS。

同樣的CDC也做了檢測限分析，數(shù)據(jù)可以說是非常漂亮，展示了非常強(qiáng)的靈敏度：

但是我們發(fā)現(xiàn)整個性能評價，都是使用體外轉(zhuǎn)錄的N gene RNA，然后用人A549細(xì)胞和viral transport medium (VTM)來稀釋，作為模擬病毒標(biāo)準(zhǔn)品做的。這樣我們不經(jīng)會問，是否有更合適的標(biāo)準(zhǔn)品用于性能評價？

按照2020年02月12號國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心發(fā)布的指導(dǎo)原則《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)》中明確指出：陽性質(zhì)控品可用1～2個病毒株為代表，應(yīng)含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列（如假病毒），陰性參考品則主要涉及對交叉反應(yīng)的驗(yàn)證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

科佰生物應(yīng)對核酸診斷的需求，開發(fā)了一系列的假病毒標(biāo)準(zhǔn)品（假病毒也是病毒，有核酸RNA和外殼蛋白組成，但是無致病性，只需P2級），幫助企業(yè)做試劑盒的性能評價，具體產(chǎn)品線為：

以2019-nCoV Gene N為例，假病毒包含全長1260bp，滿足不同客戶對不同序列的需求，假病毒含有Gene N的1260bp的RNA，同時也有完整的包膜結(jié)構(gòu)，需要用試劑盒提取，反轉(zhuǎn)錄，開展下游的dPCR檢測。我們采用了Qiagen QIAamp Viral RNA Mini Kit提取，使用蘇州銳訊開發(fā)的《新型冠狀病毒（COVID-19）核酸檢測試劑盒》一步法反轉(zhuǎn)錄，然后再PCR擴(kuò)增儀（SG-200）上對病毒的拷貝數(shù)定量。

得到2019-nCov-N Pseudovirus Standard Reference的拷貝數(shù)為5.03*10e8/ml。

用于藥物研發(fā)假病毒模型

2月16日，美國德克薩斯大學(xué)*分校和美國國家衛(wèi)生研究院科研人員聯(lián)合在預(yù)印本平臺bioRxiv上發(fā)布了對2019新型冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn)：他們確定了處于預(yù)融合構(gòu)象的2019新型冠狀病毒刺突蛋白（S蛋白）的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)，同時發(fā)現(xiàn)，人體ACE2蛋白與新型冠狀病毒S蛋白結(jié)合的親和力，比與SARS病毒S蛋白結(jié)合的親和力高10到20倍。

S蛋白通過其受體結(jié)合區(qū)識別ACE2，因此，研究人員就以受體結(jié)合區(qū)為靶標(biāo)制備抗體，目的是阻斷受體結(jié)合區(qū)與ACE2的相互作用。美國研究團(tuán)隊還檢測了幾株SARS病毒受體結(jié)合區(qū)（receptor-binding domain，RBD）特異性單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)它們與新型冠狀病毒S蛋白的受體結(jié)合區(qū)沒有明顯結(jié)合，這提示這兩種病毒受體結(jié)合區(qū)之間的抗體交叉反應(yīng)可能是有限的。

因此針對2019-nCoV的S蛋白藥物開發(fā)，尤其是大分子藥物開發(fā)，可能沒有什么捷徑可走，需要一步一步建立模型體系，篩選出有活性的藥物。

針對S蛋白和ACE2的結(jié)合阻斷，我們可以開發(fā)生化水平的檢測，比如兩種蛋白的結(jié)合阻斷ELISA，那是否有細(xì)胞水平的模型？真實(shí)的模擬病毒侵染細(xì)胞的過程，進(jìn)而阻斷，來反應(yīng)藥物的效果呢？答案是有的。

科佰生物開發(fā)了一種表達(dá)S蛋白的假病毒，該假病毒依靠S蛋白侵染目的細(xì)胞，與目的細(xì)胞結(jié)合，進(jìn)而殺死目的細(xì)胞，檢測到信號，大限度的模擬病毒的感染過程。同時該假病毒沒有致病性，只需要P2級實(shí)驗(yàn)室即可，是用于藥物研發(fā)合適的細(xì)胞水平的評估模型。

對應(yīng)的產(chǎn)品線

2019-nCoV新型冠狀病毒已然是人的公敵，看著前線醫(yī)務(wù)人員的付出，希望我們生物人，也能貢獻(xiàn)自己的力量。