1.由于基因轉(zhuǎn)染到細胞內(nèi)之后要一段時間才能表達出蛋白質(zhì)。所以細胞株篩選時不能太早;但是也不能太晚，因為轉(zhuǎn)染了外源基因的細胞代謝負荷較大，增值較慢，時間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細胞所淹沒，終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加篩選。隨著細胞的代謝，濃度和活性都會下降，所以每3-5天都要更換一次篩選液。

　　2.加抗生素的時機，主要是考慮插入到細胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表達。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般是穩(wěn)定細胞株篩選濃度的1/2。

　　關(guān)于維持濃度，有人說細胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且如果要挑選幾個陽性克隆中較高表達的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。當然，抗性基因高表達，目的基因不一定就跟著高表達。

　　此外，也需穩(wěn)定細胞系構(gòu)建培養(yǎng)液：

　　加藥篩選穩(wěn)定細胞株約6天左右，細胞會大量死亡，孔中只剩下的細胞*。這時會出現(xiàn)：

　　1.死亡的細胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有表達陽性細胞死亡，即非選擇性死亡，因此要及時換液。

　　2.孔中細胞數(shù)目很少，細胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液，再轉(zhuǎn)染后篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。

　　3.適當增加血清濃度。

>> 返回首頁